[212호 과학학술: 인삼사포닌의 생합성 원리] 인삼사포닌의 생합성 원리

본교 한방재료공학과 양덕춘 교수 연구팀이 인삼의 사포닌인 진세노사이드(Ginsenoside)의 생합성 원리를 밝혀, 진세노사이드의 대량 배양과 인삼 신품종 개발 가능성을 제시했다. 인삼은 피로회복과 면역력 증진 등에 탁월한 효능이 있는 것으로 알려져 있는데, 이러한 약리학적 효능을 일으키는 것이 진세노사이드이다. 연구팀은 그동안 수집해온 세계 인삼의 유전자원과 유전정보소스를 기반으로 진세노사이드의 생합성 원리를 규명했다. 이에 본보에서는 인삼 사포닌의 생합성 원리에 대해 자세히 알아보고자 한다.

식물 이차대사산물의 중요성과 가치

식물 천연 제품은 중요한 의약품과 필수 영양 요소를 제공하며 수천 년 동안 인간 문명에 이용되었다. 최근 들어, 식물유래 활성물질들은 화장품, 건강 보조식품, 사료 등에도 중요하게 사용되고 있으며, 산업 원료와 고부가가치 정밀 화학 물질로서 중요하게 각광받고 있다. 특히 식물 이차대사산물의 구조적으로 광대한 다양성 때문에, 새로운 구조와 활성을 가진 원료들이 무궁무진하다. 화학 합성을 통한 생산은 상당한 투자에도 불구하고, 자연적으로 발견된 복잡한 구조인, 원래의 활성을 완벽히 재현할 수 있는 원료를 제공해주지는 못한다. 또한 화학합성은 비용이 많이 들고, 일반적으로 비재생 에너지와 부산물이 요구되는 화학 정제가 필요하다. 이러한 이유 때문에 천연물로부터 신소재 개발 및 질병 치료에 이용한 높은 부가가치를 갖고 있는 이차대사산물의 정제에 많은 투자가 되고 있다.

현재 미국 제약회사인 머크(Merck)사는 열대림에 서식하는 50만 종의 식물에서 10년 내에 25종의 신약을 개발한다는 야심찬 프로젝트를 추진하고 있으며, 독일은 버드나무에서 해열진통제인 아스피린을, 은행나무에서 혈액순환제인 징코플라보네를 개발했다. 일본은 버섯에서 렌티난이라는 물질을 추출해 암치료보조제로 판매하고 있다. 중국도 개똥쑥에서 말라리아 치료제를, 오미자에서 간장질환 치료제를 개발하였다. 뿐만 아니라 부가가치도 매우 높아 주목에서 추출한 항암제인 탁솔(Taxol)은 kg당 1,200만 달러(144억 원)에 달할 정도로 높은 가격을 형성하고 있다. 이러한 신약개발이 아니더라도 스위스 파마톤사의 경우 인삼을 전혀 생산하지 않음에도 불구하고 인삼제품의 표준화(standardization)를 통하여 한 해 3억 달러 이상의 매출을 올리고 있어 우리나라와 대조적이다. 식물조직배양을 통한 신소재 생산의 가장 큰 장점 중의 하나인 원료의 표준화가 매우 뛰어나다는 점을 이용한 예라고 할 수 있다. 천연물의 이차대사산물은 무궁무진한 연구 및 고부가가치의 활용성을 지녔다고 할 수 있으며, ‘생물 주권’국제전쟁에서 우위를 확보하기 위해서는 향후 지속적인 연구가 필요한 분야이다.

인삼 사포닌의 효능 및 구조

고려인삼(Panax ginseng Meyer)은 한국의 대표적인 특용 작물이고 탁월한 생리활성이 검증됨에 따라 세계 각국에서 인정받았다. 한국뿐만 아니라 중국, 일본, 미국, 캐나다, 러시아 등 많은 국가에서 인삼 재배가 대량으로 이루어지고 있으며 고부가가치의 인삼제품개발에 관심이 모이고 있다. 고려인삼의 활성성분에 대한 과학적 연구는 1960년대부터 활발히 수행되었으며, 뇌기능 개선, 통증 감소 효과, 항종양 활성을 비롯 한 암예방 효과, 면역기능의 향상, 항당뇨효과, 간기능 향상, 혈압 조절, 항피로와 항스트레스 효과, 갱년기 장애와 성기능 개선, 항산화 및 항노화효과 등의 효능이 밝혀지면서 전 세계 적으로 주목받는 식물적 치료제가 되었다. 인삼의 활성 성분 중에서 가장 많은 양을 차지하면서도 인삼 효능을 대변하는 물질은 트리터펜(triterpene) 사포닌 성분인 진세노사이드(ginsenoside)이다. 진세노사이드는 거의 인삼 속(Panax) 식물들에서만 특이하게 발견되며, 대부분의 5환계 사포닌 구조와 달리, 배당체 구조가 4환계의 담마렌 (dammarane) 타입이다. 수산화기(hydroxyl group)와 당이 붙는 위치와 개수에 따라 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등 의 다이올(protopanaxadiol)계와 Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1, F1 등의 트라이올(protopanaxatriol)계로 크게 나눠지며, 당 의 종류와 개수에 따라 그 종류가 다양하다. 고려인삼 뿌리에 15여 종 이상이 있으며, 홍삼 특이성분 및 인삼 등을 포함하면 약 40여 종 이상이 존재한다. 물질 분리 및 정제, 구조에 따른 효능의 차이, 인체 대사에 따른 구조의 변화 및 약리동력학적 효능 연구 등에 대한 연구가 한국 및 중국에서 활발하게 진행되고 있다.

구조 동정 및 효능 분석 연구에 비하여, 인삼 사포닌이 어떻 게 식물체 내에서 생성되어지는지의 생합성 경로에 대하여는 연구가 부족한 현황이지만, 이러한 연구를 통하여, 다른 식물 및 미생물 등에서 대사공학적으로 생산하는 기술과 전략을 구축할 수 있고 이를 토대로 농업 및 산업적으로 활용할 수 있다.

Figure 1

인삼 지놈프로젝트의 현황과 유전정보분석

유전정보를 알고 생명현상을 이해하기 위해서 1990년부터 시작된 인간 지놈(genome) 프로젝트를 통해 유전정보들이 밝혀지면서 인간의 질병을 예측하고 유전자 편집을 통해 치료할 수 있는 시대가 열리고 있다. 인삼의 지놈분석도 1998년부 터 시작되었고, 현재 아직 진행 중이다. 인삼의 조직별(잎, 뿌리, 열매) 및 연근별 제작된 발현유전단편(EST)의 제작 및 분석을 통해 약 2만여 개의 유전자를 수집하였으며 인삼 염기서열 분석은 사포닌 생합성 유전자들의 발굴의 시초가 되었다.

고려인삼은 인간의 46개 염색체 수보다 많은 수 의 48개의 염색체를 가지고 있으며, 중국삼 (Panax notoginseng), 일본삼(Panax japonicus) 이 갖고 있는 수의 두 배로서, 고려인삼과 미국삼 (Panax quinquefolius)이 가장 마지막에 진화되면서 염색체 수가 늘어난 것으로 이해되고 있다.

진세노사이드는 인삼이 여러 환경 스트레스에 노출되었을 때 증가할 수 있는데, 특히 쟈스몬산 (jasmonic acid) 호르몬에 의해 높은 증가를 보인다. 따라서 대조구에 비하여 쟈스몬산 처리에 반응하여 발현이 증가되는 유전자들을 대상으로 진세노사이드 생합성에 관여할 것이라는 추측으로 기능을 분석하기 시작하였다. 다른 식물에서의 사포닌 생합성에 관여하는 유전자와의 상동성을 확인한 후, 인삼 유전자 각각의 전체 서열을 과대발현 벡터를 제작하여 인삼에 형질전환(transformation)시켰을 때 진세노사이드가 증가하는지 물질분석을 통해 검정한다. 또는 유전자 발현을 억제시켰을 때 진세노사이드가 감소하는지를 확인하는 방법으로 진세노사이드 생합성 유전자를 탐색해왔다.

진세노사이드의 생합성 과정의 이해

일반적으로 트리터펜 사포닌의 골격을 이루기 위해서는 이소프레노이드(isoprenoid) 단위가 단계별 조합을 이뤄 탄소 30개 구조인 스쿠알렌(squalene)으로 생합성된다. 일반적으로 모든 진핵세포에 존재하는 세포질 내 메발론산(mevalonic acid) 경로에 의해 생성되며, 최근 들어, 플라스티드 내 존재하는 다른 경로가 생합성에 기여할 것이라는 연구결과들도 있다. 스쿠알렌은 가장 단순한 트레터펜 구조이며, 최초로 물고기의 간 지방에서 발견되었고 식물의 유류와 동물의 지방에서 발견되었다. 불포환된 결합을 가진 스쿠알렌은, 다양한 다환형의 트리터펜 전구체로 작용된다.

스쿠알렌까지의 생합성은 모든 생명체에서 스테롤을 합성하는 공통 경로이다. 이 경로에 관여하는 효소들, HMGR, squalene synthase(SS), squalene epoxidase(SE) 등을 억제하는 물질들은 콜레스테롤 합성 저해제로 사용되고 있다. 인삼에서도 마찬가지로 HMGR 효소의 저해제 처리에 의하여 진세노사이드 생합성이 감소하는 것으로 보아, 상기 유전자가 진세노사이드 생합성에 중요하게 작용하는 것을 알 수 있다.

그렇다면, 공통 전구체인 스쿠알렌으로부터 진세노사이드는 어떻게 만들어질 수 있을까? 스쿠알렌 및 옥시도스쿠알렌 (2,3-oxidosqualene)의 환화로 다양한 구조의 트리터펜 구조가 형성된다. 이때, 환화에 관여하는 효소(oxidosqualene cyclase, OSC)는 동물과 곰팡이에 한 개의 lanosterol synthase(LAS)만 존재하는 것과 달리, 놀랍게도 현재까지 식물에서는 80여 종이 발견되었다. 지놈이 밝혀지고 생활사가 짧아 모델식물로 연구되는 애기장대 식물에서는 13개의 OSC 가 밝혀졌지만, 하나의 전구체에서 다양한 물질로 전환되어지는 유전자의 조절 기작에 대해서는 연구가 더 필요하다. 인삼 에서는 다른 식물과 마찬가지로 스테롤 합성에 관여하는 LAS, cycloartenol synthase(CAS) 효소, 트리터펜 생합성에 관여하는 dammarenediol synthase(DDS)와 β-amyrin synthase(β-AS)가 발견되었다. LAS 효소가 결핍된 효모에 인삼의 OSC 유전자들을 도입시켰을 때, 각각의 트리터펜 구조를 생성하는 것을 확인함으로써, 유전자의 최종 생산물을 밝힐 수 있었다. 다른 식물 사포닌은 주로 5환 트리터펜인 β- amyrin이 합성되는데 이에 관여하는 β-AS가 인삼에서도 마찬가지의 작용을 하여 최종적으로 인삼 뇌두에 존재하는 진세노사이드 R0를 생성한다. 대부분의 진세노사이드 구조는 인삼 특이적 dammarenediol synthase(DDS) 효소에 의해 4환 성 dammarenediol을 형성하게 된다.

형성된 트리터펜 환구조는 다음 두 단계에 의하여 그 구조 가 다양해진다. Cytochrome P450(P450) 효소에 의해 수산화기를 붙인 후, glycosyltransferase(GT) 효소들에 의해 당을 붙이면서 다양한 종류의 진세노사이드가 합성될 수 있는 것이다. 2015년, 진세노사이드 생합성의 마지막 베일인 GT 효소 몇몇이 중국과 국내 연구진에 의해 밝혀지면서, 효모에서 직접 생산하는 대사공학의 길이 열리게 되었다. 특히, 인삼 섭취 시 장내 미생물에 의해 당을 잘라내어 형성되는 대사체로서 항암효과가 뛰어난 것으로 밝혀진, 진세노사이드 compound K를 효모에서 직접 생성할 수 있게 되었다. 식물체 내에서는 아직까지 발견되지 않았으며, 아마도 당이 붙은 개수가 적어 그 독성이 커서 아주 미량으로 존재하거나 다음 진세노사이드로 전환되는 속도가 아주 빠를 것으로 추정되고 있다. 향후, 밝혀질 GT 효소들에 의하여 원하는 특정 진세노사이드만을 생산할 수 있는 길이 멀지 않을 것이다.

진세노사이드 생합성 유전자들이 많이 밝혀졌지만, 하나 이상의 유사 유전자들이 발견되면서, 같은 유전자에서 나온 약 간 다른 단백질들인 동위체(isozyme)들이 사포닌 생합성을 서로 다르게 조절하는지에 대한 연구가 아직 밝혀지지 않았다. 고려인삼에의 연구 이후, 최근 Panax 속 미국삼과 중국삼 에서도 상동 유전자들이 밝혀지고 있기 때문에, 인삼 속의 식물들이 서로 다른 진세노사이드 함량과 종류를 어떻게 합성하 는지 유전자의 기작을 통해 연구할 수 있다. 또한 유전자들을 조절하는 전사인자(transcription factor)에 대한 향후 연구가 필요하다. 특히, 쟈스몬산과 같은 호르몬 처리에 의하여 유 전자 생합성 유전자들을 조절하는 전사인자들에 대하여 그 기능을 연구 중에 있으며, 이러한 전사인자들을 조절함으로써 진세노사이드의 특정세포에서의 생합성을 증가시킬 수 있을 것이다.

Figure 2

인삼 식물 내 진세노사이드의 축적과 생리학적 기능

고려인삼은 재배기간이 길고, 반음지식물이기 때문에 차광 막을 설치하여야 하는 까다로움이 있으며, 연작이 불가능하다. 4년 이상부터 뿌리를 수확하지만 긴 재배기간 동안 토양 내 병충해 및 중금속 또는 강한 빛 등의 환경 스트레스에 의해 수확량이 감소되고 상품성이 떨어지게 된다. 진세노사이드가 방어 기작에 관여하기 위해 생성되는 것이라고 알려져 있지만, 실질적으로 인삼 내 어디서 어떻게 생성되고 인삼 내에서 어떠한 생리학적 역할을 하는지에 관하여는 연구된 바가 적 다. 최근 연구들은, 진세노사이드가 다양한 인삼 조직에 함유되어 있고, 연근별, 종별, 환경에 따라 함량과 종류가 달라진다는 것을 보여준다. 4년근 또는 6년근 뿌리를 주로 약용으로 사용해왔지만, 잎에 함량이 더 높고, 열매의 경우 진세노사이드 Re를 가장 많이 갖고 있다. 인삼 연근이 높아질수록 잎에 서의 함량은 줄어들고 뿌리에서의 함량은 높아지는 연구 결과 들은 진세노사이드가 잎에서 더 많이 생합성되고 뿌리로 축적 될 수 있다는 진세노사이드의 이동 가능성을 제기한다. 특히, 잎의 엽록체 등에서 발견되고 액포에서는 발견되지 않은 진세노사이드가 뿌리의 액포에서는 발견되어서, 주로 뿌리의 액포에 저장될 것이라고 예측되고 있다.

식물체 내 조직별 다른 종류의 진세노사이드 축적은 식물체 내 생장 또는 방어기작과 관련하여 서로 다른 역할을 할 것이 라는 가정을 하게 되고, 각각의 처리에 따른 진세노사이드의 프로파일링을 통하여 그 기능을 예측하고 있다. 예를 들어, 진세노사이드 Rb1와 같은 다이올 계열은 곰팡이와 같은 생물학적 스트레스 방어에 역할을 할 것으로 보이며, 트라이올계열은 저온 처리에 의해 증가되는 것을 확인함으로써, 환경 스트레스와 관련하여 방어 역학을 수행할 것으로 예측된다. 식물 내 진세노사이드가 종류별로 무슨 역할을 하는지 부정확하지만, 이러한 연구는 특정 스트레스 처리에 의하여 원하는 진세노사이드의 생합성을 증가시키는 데 이용될 수 있다.

생합성 원리를 이용한 진세노사이드의 생물공학적 생산

의약품 관련 트리터펜의 생산에 식물조직배양이 많이 이용되어 왔다. 목표로 하는 물질을 무균상태의 생물반응기에서 식물의 세포, 조직, 기관을 이용하여 생산하므로 유전적으로 안정적이고 환경에 영향을 받지 않으며, 지속적인 생산이 가능하다. 탈분화된 캘러스 또는 캘러스로부터 유기한 부정근을 이용하여 진세노사이드를 생산할 수 있으며, 교반탱크 또는 공기가 주입되는 생물반응기에서 배양할 수 있다. 하지만, 식물의 조직배양으로 생산되는 물질은 원래 식물이 생산하는 양보다 적어서 생산의 최적조건을 찾기 위한 노력이 많이 수행되었다. 함량을 높이기 위해 유도제(elicitor) 물질들의 처리 연구가 수행되었다. 이러한 유도제는 식물의 스트레스를 유도 하기 때문에 식물의 생장량의 저해를 가져온다. 따라서 어느 정도 생장한 후, 쟈스몬산을 처리하는 최적조건과 대량배양 시스템을 이용하여 진세노사이드의 최적 생산을 가져올 수 있다.

진세노사이드의 생합성에 관여하는 유전자들이 하나둘 밝혀지면서, 유전자를 인삼에 형질전환하여 조직배양한 부정근을 이용하여 진세노사이드의 생산을 증가시킬 수 있다. 또는, 빨리 자라고 잎이 넓은 담배에 인삼 유전자를 형질전환하여 잎에서 많은 양의 진세노사이드를 생산하거나, 종자특이적 프 로모터를 이용하여 벼와 같은 곡류에서 생산할 수 있는 방안도 현재 연구 추진 중이다. 그리고 마지막으로 식물보다 생장 속도가 빠른 미생물에 DDS, P450, GT 유전자 세트를 도입하 여 원하는 진세노사이드만을 대량 생산하는 방법이 가장 큰 이슈로 각광받고 있다. 아직 밝혀지지 않은 GT 유전자들이 많고, 인삼 특이적 효소들의 조절 기작에 대해서도 연구가 필 요하다. 이러한 유전자의 생합성 경로를 이해한다는 것은, 경로 조절을 통해 농업적으로 기능성 작물을 생산할 수 있고, 고 부가가치의 산업과 연결될 수 있기에 앞으로도 그 연구가치가 크다고 사료된다.

김유진 / 한방재료공학과 연구교수

이차대사산물(secondary metabolite): 1906년 아편으로부터 진통효과가 있는 모르핀 (morphine)을 분리한 것을 시작으로 천연물에 존재하여 약효를 나타내는 다수의 성분들은 모두 이차대사산물이라는 것이 알려졌다. 식물은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질과 같이 세포가 그 기능을 수행하는데 있어서 필수적인 물질들이 일차대사산물 (primary metabolite)을 만들뿐 아니라, 스스로를 방어하기 위해서 이차대사산물을 생산한다. 식물이 자신의 생존에 보조 수단으로 만들어 놓은 이차대사산물을 우리가 추출 또는 분리정제하여 의약품, 염료, 색소, 향료, 식품 첨가제로 사용하고 있다. 이차대사산물은 식물체 내 방어 역할을 수행하고, 환경과 식물의 상호 작용에 있어서도 중요하며, 특정 식물 종마다 서로 다른 유용 이차대사산물을 생산하고, 이들은 식물의 생활사의 특정 발달 단계에 특화된 세포, 기관 또는 조직에서 생산된다.

사포닌(saponin): 식물계에 널리 존재하는 배당체의 비당부분 (aglycone)이 여러 고리 화합물로 이루어진 것을 총칭한 것으로 물을 가해 진탕함에 따라 미세벌집모양의 거품을 형성하기 때문에 latin어 sapo에서 유래된 어원을 따라 saponin으로 통칭되었다. 사포닌은 탄 소 30개로 구성된 트리터펜 사포닌(triterpenoid saponin)이 주류를 이루고 있으며 5환성인 oleanane, ursane, lupane, hopane, taraxerane형 등이 존재한다. 4환성인 사포닌은 인삼사포닌인 dammarane형과, lanostane, cholestane형 등이 존재한다.

발현유전단편(EST, Expressed Seqeunce Tag): 유전자에서 인트론이 제거되고, 엑손만 연결된 cDNA의 5、혹은 3、말단 의 부분적인 염기서열을 결정하여 유전자를 표지한 것이다. 세포에서 추출한 mRNA를 기반으로 제작한 상보적DNA(cDNA)에서 얻게 된다. 유전체 중에서 실체로 기능하고 있는 부분의 배열정보라고도 할 수 있다.

[참고문헌]

1) YJ Kim†*, J Silva†, D Zhang, J Shi, SC Joo, MG Jang, WS Kown, DC Yang* (2016), Development of interspecies hybrids to increase ginseng biomass and ginsenoside yield. Plant Cell Rep. In press.

2) YJ Kim, D Zhang, DC Yang (2015), Biosynthesis and biotechnological production of ginsenosides. Biotechnol Advances. 33: 717-735.

3) S Rahimi, YJ Kim*, DC Yang* (2015), Production of ginseng saponins: elicitation strategy and signal transductions. Appl Microbiol Biotechnol. 99: 6987-6996.

* 그림 설명

-그림 1: 인삼의 생활사와 진세노사이드의 축적 변화

-그림 2: 진세노사이드의 생합성 경로

작성자: khugnews

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